Il Pyrosequencing è una tecnologia di sequenziamento mediante sintesi. La tecnica consente il monitoraggio in tempo reale della sintesi di DNA mediante il rilevamento della bioluminescenza prodotta al termine di una cascata di reazioni enzimatiche, la quale, a sua volta, viene innescata dall’incorporazione di un nucleotide. L’intensità del segnale luminoso è direttamente proporzionale al numero delle basi introdotte dalla polimerasi nel nuovo filamento di DNA che si va formando per estensione del primer di sequenziamento, appaiato al prodotto di amplificazione denaturato.
Il Pyrosequencing può essere impiegato per il sequenziamento de novo di brevi frammenti di DNA, ad esempio in microbiologia per l’identificazione di genotipi o specie microbiche e per l’analisi di sostituzioni nucleotidiche puntiformi sia singole che multiple, anche tetralleliche, inserzioni e delezioni di una o poche basi, con un’elevatissima accuratezza ed un’attendibilità paragonabile a quella del sequenziamento tradizionale. Inoltre, grazie alla sua capacità di fornire dati quantitativi, si propone come l’unico metodo di sequenziamento in grado di determinare le frequenze alleliche, nonché gold standard per l’analisi del grado di metilazione del DNA.
La semplicità e velocità della procedura e la presenza di un sistema intrinseco al software per il controllo di qualità dei dati hanno fatto del pyrosequencing una tecnologia applicabile anche nei laboratori di diagnostica clinica. Queste stesse caratteristiche, unite all’estrema versatilità del metodo, in termini sia di applicazioni, sia di campioni/saggi eseguibili in parallelo, e al fatto di essere un sistema completamente aperto e flessibile, hanno fatto apprezzare il Pyrosequencing anche a molti ricercatori in tutto il mondo, come dimostrano le migliaia di pubblicazioni a riguardo.